kaiyun官網(wǎng)中國 開云網(wǎng)址賽業(yè)生物長期致力于大小鼠基因編輯和細胞基因編輯領(lǐng)域，擁有經(jīng)驗豐富的專家團隊和成熟穩(wěn)定的技術(shù)平臺。細胞基因編輯基于傳統(tǒng)CRISPR/Cas9升級而成的CRISPR-Pro技術(shù)，采用電轉(zhuǎn)方式進行轉(zhuǎn)染，雙gRNA同時打靶，可實現(xiàn)更徹底的大片段基因敲除、基因敲入和精準點突變，與移碼突變相比，敲除更徹底，各項實驗數(shù)據(jù)表明采用CRISPR-Pro技術(shù)更高效。賽業(yè)生物模式動物一站式服務(wù)平臺還有alphaknockout基因打靶專家系統(tǒng)、ES打靶技術(shù)，實現(xiàn)了模型建立的高效、穩(wěn)定和數(shù)據(jù)可靠性，提供的動物基因編輯服務(wù)涵蓋了藥篩評價小鼠模型、定制動物模型、定制模型下游服務(wù)和無菌鼠技術(shù)平臺等，可以滿足大部分客戶的科研需求。

　　1987年，日本科學家在研究大腸桿菌的時候發(fā)現(xiàn)其基因組上存在一些看起來“奇怪”的重復(fù)結(jié)構(gòu)：有一段29堿基的序列反復(fù)出現(xiàn)了5次，且兩兩之間被32個堿基形成的序列隔開了！但這個發(fā)現(xiàn)在當時并沒有引起科學界的很大關(guān)注，畢竟在自然界的生物體內(nèi)，各種奇奇怪怪的發(fā)現(xiàn)實在太多。然后僅僅幾年后，1993年西班牙科學家弗朗西斯科莫西卡在另外一種細菌——地中海噬鹽菌中又一次發(fā)現(xiàn)了這種奇特的重復(fù)序列，這引起了莫西卡的興趣，于是莫西卡在其他細菌中繼續(xù)尋找，到2000年，莫西卡竟然在超過20種不同微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)DNA結(jié)構(gòu)，從此這種重復(fù)序列就有了其學術(shù)大名：成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。

　　對于任何有機生命體來說，保存、復(fù)制和傳遞遺傳物質(zhì)都是一件非常精細、困難也很占用資源的事情，因此在這么多不同的物種中都保留了這么一長串的CRISPR序列，必定有其重要的用處。隨后，科學家通過對比多種細菌的幾千段CRIPSR序列后發(fā)現(xiàn)，在CRIPSR序列中存在許多片段與病毒的基因組序列高度一致，雖然不是完整的病毒基因組序列，但這些序列被夾在一段細菌精心設(shè)計的重復(fù)序列中，進一步的研究證實，這些與病毒基因組高度一致的序列來自于“噬菌體”——一類可以感染和侵襲細菌的病毒，這不禁讓人聯(lián)想到細菌會不會是靠對CRISPR序列的“記憶”來發(fā)揮其對噬菌體的免疫。2007年，一群在杜邦公司旗下的丹尼斯克食品配料公司工作的科學家在嗜熱鏈球菌中證明了CRISPR序列對于細菌免疫系統(tǒng)的功能，自此，CRISPR技術(shù)才開始走進科學家的視野。

　　2013年，Jennifer Doudna、哈佛大學醫(yī)學院的George Church和麻省理工大學博德研究所的張鋒分別帶領(lǐng)3個研究團隊相繼證明了CRISPR序列與Cas9蛋白結(jié)合可以在人類細胞中高效地定位、剪切和修改基因組。2014年，美國專利與商標局將CRISPR-Cas9技術(shù)相關(guān)的第一個專利授予給張鋒所在的博德研究所，并將張鋒作為專利的第一發(fā)明人，這也開啟了張鋒和Jennifer Doudna漫長的專利之爭。2019年，張鋒團隊在Nature munications發(fā)表論文，稱開發(fā)了第三種基因編輯工具CRISPR-Cas12b，并能在哺乳動物和人體中進行有效的基因編輯，同年8月，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學院（ETH）的研究團隊實現(xiàn)了同時對細胞內(nèi)25個基因靶點進行編輯，為CRISPR-Cas技術(shù)帶來了革命性突破。

　　基因編輯技術(shù)是對細胞中的DNA序列進行精準操作從而改變細胞命運和生物體特征的技術(shù)，該技術(shù)為提高人類對于遺傳學的理解以及遺傳疾病的治療提供了重要的工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和單鏈向?qū)NA（sgRNA）所組成，其中Cas9蛋白起切割DNA雙鏈的作用，sgRNA起向?qū)У淖饔茫趕gRNA的向?qū)峦ㄟ^堿基互補配對原則Cas9蛋白可對不同的靶部位進行切割，實現(xiàn)DNA的雙鏈斷裂（如下圖）。CRISPR-Cas9是繼鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶（TALEN）之后出現(xiàn)的第3代基因編輯技術(shù)，與ZFNs和TALENs的Fok I酶只有在二聚化才具有切割活性不同的是，Cas9在sgRNA的引導(dǎo)下以單體蛋白的形式就可發(fā)揮功能，從而避免了復(fù)雜的蛋白設(shè)計或組裝的需要。CRISPR-Cas9的編輯效率和精確性相比于ZFN和TALEN有了顯著提高，其應(yīng)用領(lǐng)域也開始從遺傳性疾病擴展到更多復(fù)雜的疾病，目前，CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)被用于操縱培養(yǎng)細胞和原代細胞、編輯動物和植物的基因組，極大地加快了基礎(chǔ)研究的步伐。

　　CRISPR系統(tǒng)要實現(xiàn)sgRNA和Cas9蛋白的遞送，通?？蓮腄NA水平、RNA水平和蛋白水平進行遞送，即遞送含編碼Cas9蛋白和sgRNA的質(zhì)粒、遞送sgRNA和編碼Csa9蛋白的mRNA，直接遞送sgRNA和Cas9蛋白。其中從DNA水平遞送編碼Cas9蛋白和sgRNA質(zhì)粒的方式有病毒法、電轉(zhuǎn)法和脂質(zhì)體法，其中病毒法具有操作簡單、成本低和穩(wěn)定性高的特點，是目前較為常用的一種方式，但也存在脫靶率較高和基因整合的風險。而從RNA水平的遞送則是將編碼Cas9蛋白的mRNA和sgRNA遞送到細胞質(zhì)，在核糖體的作用下翻譯成蛋白質(zhì)，由于mRNA在體內(nèi)或體外均容易降解，此方式需要采用合適的方法保護mRNA不受降解。而遞送Cas9蛋白和sgRNA則最為直接簡便，由于不用經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，使得編輯過程更加快速高效，且脫靶率更低，但此方法的難點在于遞送載體的選擇和構(gòu)建，開發(fā)新型載體如脂質(zhì)體、金納米顆粒、陽離子聚合物等對于此方法的廣泛應(yīng)用十分重要。

　　病毒載體和蛋白-RNA復(fù)合物電穿孔是目前CRISPR常見的兩種遞送方式，其中體外研究較受歡迎的運輸方式是將Cas9組裝進蛋白-RNA（核糖蛋白復(fù)合物，RNP）復(fù)合物然后使用電穿孔進行運輸，而體內(nèi)運輸釋放過程具有更大的挑戰(zhàn)性，一般會采用病毒載體進行運輸。病毒載體包括慢病毒（LV）、腺病毒（AdV）以及腺相關(guān)病毒（AAV），相比于其他載體，病毒載體在運輸效率以及組織特異性方面具有很大優(yōu)勢。近幾年，由于AAV載體特有的優(yōu)勢，如具有組織特異性以及較低的免疫原性，使其在應(yīng)用于基因治療產(chǎn)品開發(fā)上表現(xiàn)出了極大的潛力。電穿孔法則是體外細胞基因編輯元件運輸?shù)闹饕绞?，通過高壓電流脈沖細胞，在細胞膜上產(chǎn)生瞬間的納米級孔隙，從而允許RNP進入細胞，幾乎所有類型的細胞，一旦確定了電穿孔條件，都可以實現(xiàn)較高效率的瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，但高壓脈沖引起大量細胞死亡和僅部分成功的膜修復(fù)，與化學轉(zhuǎn)染方法相比需要使用更大量的細胞。

　　目前CRISPR-Cas9技術(shù)主要用于細胞和動物水平的模型建立，而在腫瘤研究領(lǐng)域，已有多種基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的腫瘤細胞和動物模型被成功建立，并用于腫瘤基因、藥物靶點和耐藥性等方面的臨床前驗證。

　　癌癥動物模型的建立是研究癌癥相關(guān)基因功能的一個重要手段，CRISPR/Cas9技術(shù)極大地簡化了癌癥動物模型的建立，降低了成本又加快了建模周期。目前，采用CRISPR/Cas9建立的腫瘤動物模型最常用的為小鼠，其次為大鼠、豬等。例如張峰團隊通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功地構(gòu)建了小鼠肝癌和肺癌模型，他們首先利用Cre-loxP系統(tǒng)將Cas9基因敲入小鼠體內(nèi)，構(gòu)建Cas9小鼠模型后，將篩選出來的3個基因：KRAS、p53和LKB1基因的sgRNA分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，模型鼠發(fā)展出了肉眼可見的肺腺癌病理表征，從而證明了KRAS、p53和LKB1基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用[1]。賽業(yè)生物采用基于傳統(tǒng)CRISPR/Cas9升級而成的CRISPR-Pro技術(shù)已經(jīng)為數(shù)千位科研人員成功構(gòu)建了腫瘤研究相關(guān)的基因編輯小鼠和大鼠模型，且研究成果在Nature Communication、Leukemia等頂尖期刊發(fā)表。

　　對于發(fā)病機制并不明確的癌癥，通過CRISPR/Cas9技術(shù)可研究特定基因在腫瘤發(fā)生和進展過程中的作用。目前采用CRISP/Cas9技術(shù)建立的腫瘤模型有肺癌、乳腺癌和急性髓細胞白血病細胞系等，例如有研究者采用CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)沉默骨肉瘤細胞系KHOS和U-2OS中CDK11基因表達，發(fā)現(xiàn)CDK11基因沉默后骨肉瘤增殖和侵襲能力顯著減弱[2]。慢性髓系白血病的發(fā)生常與體內(nèi)抑癌基因ASXL1的突變有關(guān)，并且影響患者的預(yù)后。另外有研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向修復(fù)了KBM5細胞中ASXL1的無效突變，顯著降低了KBM5細胞的增殖速率，增強了細胞的分化，并且經(jīng)過ASXL1基因修復(fù)的荷瘤小鼠的生存時間較未經(jīng)ASXL1修復(fù)的荷瘤小鼠生存時間長。另外，劍橋大學等多個研究機構(gòu)的科研人員對來自30種不同惡性腫瘤的324種腫瘤細胞系進行了基因組規(guī)模的CRISPR/Cas9篩選，發(fā)開了名為Project Score的數(shù)據(jù)庫，從而為尋找腫瘤的作用靶點提供幫助。賽業(yè)生物提供的細胞基因編輯服務(wù)已經(jīng)在198種腫瘤細胞上成功構(gòu)建了基因敲除、基因敲入的細胞模型，例如采用CRISPR-Pro技術(shù)進行細胞基因敲除可實現(xiàn)大片段的基因敲除，相比于常規(guī)的移碼突變敲除得更加徹底。

　　CRISPR/Cas9技術(shù)在未來腫瘤研究及治療方面的發(fā)展?jié)摿κ菬o限的，但是我們必須清醒地認識到，這項技術(shù)還存在很多尚未解決的問題，比如脫靶效應(yīng)，應(yīng)用于人體時的倫理問題、安全性問題等。但可以預(yù)見的是，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷創(chuàng)新最終會解決上述難題，為腫瘤的治療研究提供新的思路和方向，為腫瘤患者帶去新希望。

　　賽業(yè)生物長期致力于大小鼠基因編輯和細胞基因編輯領(lǐng)域，擁有經(jīng)驗豐富的專家團隊和成熟穩(wěn)定的技術(shù)平臺。

　　細胞基因編輯基于傳統(tǒng)CRISPR/Cas9升級而成的CRISPR-Pro技術(shù)，采用電轉(zhuǎn)方式進行轉(zhuǎn)染，雙gRNA同時打靶，可實現(xiàn)更徹底的大片段基因敲除、基因敲入和精準點突變，與移碼突變相比，敲除更徹底，各項實驗數(shù)據(jù)表明采用CRISPR-Pro技術(shù)更高效。

　　除了CRISPR-Pro技術(shù)以外，賽業(yè)生物模式動物一站式服務(wù)平臺還有alphaknockout基因打靶專家系統(tǒng)、ES打靶技術(shù)，實現(xiàn)了模型建立的高效、穩(wěn)定和數(shù)據(jù)可靠性，提供的動物基因編輯服務(wù)涵蓋了藥篩評價小鼠模型、定制動物模型、定制模型下游服務(wù)和無菌鼠技術(shù)平臺等，可以滿足大部分客戶的科研需求。

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